Perbedaan antara Sanger Sequencing dan Pyrosequencing | Sanger Sequencing vs Pyrosequencing

Perbedaan Kunci - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing

Urutan DNA sangat penting untuk analisis DNA sejak pengetahuan dari susunan nukleotida yang benar pada daerah DNA tertentu mengungkapkan banyak informasi penting tentang hal itu. Ada metode sekuensing DNA yang berbeda. Sever sequencing dan Pyrosequencing adalah dua metode sekuensing DNA yang berbeda yang banyak digunakan dalam Biologi Molekuler. Perbedaan utama antara sekuens Sanger dan Pyrosequencing adalah bahwa sekumpulan Sanger menggunakan dideoxynucleotides untuk menghentikan sintesis DNA untuk membaca urutan nukleotida sementara pyrosequencing mendeteksi pelepasan pirofosfat dengan menggabungkan nukleotida dan mensintesis urutan komplementer untuk membaca urutan yang tepat dari urutan.

DAFTAR ISI

1. Ikhtisar dan Perbedaan Kunci

2. Apa itu Sanger Sequencing

3. Apa itu Pyrosequencing

4. Side by Side Comparison - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing

5. Ringkasan

Apa itu Sanger Sequencing?

Sekuensing Sanger adalah metode sekuensing DNA generasi pertama yang dikembangkan oleh Frederick Sanger dan koleganya pada tahun 1977. Ini juga dikenal sebagai sekuensing sekuensing

atau karena didasarkan pada penghentian rantai oleh dideoxynucleotides (ddNTPs). Metode ini banyak digunakan selama lebih dari 30 tahun sampai Generasi Baru Sequencing (NGS) dikembangkan. Teknik sekuensing sanger memungkinkan ditemukannya nukleotida yang benar atau pelekatan fragmen DNA tertentu. Ini didasarkan pada penggabungan ddNTPs yang selektif dan penghentian sintesis DNA selama replikasi DNA in vitro . Tidak adanya kelompok 3 'OH untuk melanjutkan pembentukan ikatan fosfodiester antara nukleotida yang berdekatan adalah ciri khas ddNTPs. Oleh karena itu, begitu ddNTP dilekatkan, elongasi rantai berhenti dan berakhir dari titik itu. Ada empat ddNTPs - ddATP, ddCTP, ddGTP dan ddTTP - yang digunakan dalam sekuens Sanger. Nukleotida ini menghentikan proses replikasi DNA saat mereka digabungkan ke dalam untai DNA yang tumbuh dan menghasilkan berbagai panjang DNA pendek. Elektroforesis gel kapiler digunakan untuk mengatur untaian DNA pendek ini dengan ukurannya pada gel seperti yang ditunjukkan pada Gambar 01.

Gambar 1: Elektroforesis gel kapiler DNA DNA pendek yang disintesis

untuk

replikasi DNA in vitro <, hanya sedikit persyaratan yang harus diberikan. Mereka adalah enzim DNA polimerase, DNA template, primer oligonukleotida, dan deoxynucleotides (dNTPs). Dalam sekuens Sanger, replikasi DNA dilakukan di empat tabung tes terpisah beserta empat jenis ddNTPs secara terpisah. Deoxynucleotides tidak sepenuhnya diganti oleh masing-masing ddNTPs. Campuran dNTP tertentu (misalnya; dATP + ddATP) disertakan dalam tabung dan direplikasi. Empat produk tabung terpisah dijalankan pada gel di empat sumur terpisah. Kemudian dengan membaca gel, urutannya bisa dikonstruksi seperti yang ditunjukkan pada Gambar 02.

Gambar 02: Sekuens Sanger

Sebutan warna adalah teknik penting yang membantu banyak bidang biologi molekular. Proyek genom manusia berhasil diselesaikan dengan bantuan metode berbasis sequencing Sanger. Sekuensing Sanger juga berguna dalam sekuensing DNA target, penelitian penyakit kanker dan genetik, analisis ekspresi gen, identifikasi manusia, deteksi patogen, urutan mikroba dll.

Ada beberapa kelemahan sekuens Sanger:

Panjang DNA yang sequencing tidak boleh lebih lama dari 1000 pasangan basa

Hanya satu untai yang bisa diurutkan satu per satu.

• Prosesnya memakan waktu dan mahal.
• Oleh karena itu, teknik sekuensing canggih baru dikembangkan dengan waktu untuk mengatasi masalah ini. Namun, sekuens Sanger masih digunakan karena hasil yang sangat akurat sampai sekitar 850 fragmen panjang pasangan dasar.
• Apa itu Pyrosequencing?

Pyrosequencing adalah teknik sekuensing DNA baru yang didasarkan pada "sequencing by synthesis". Teknik ini bergantung pada pendeteksian pelepasan pirofosfat pada penggabungan nukleotida. Proses ini digunakan oleh empat enzim yang berbeda: Polusi DNA, ATP sulfurylase, luciferase dan apyrase dan dua substrat adenosine 5 'phosphosulfate (APS) dan luciferin.

Proses dimulai dengan ikatan primer dengan kerangka DNA beruntai tunggal dan DNA polimerase memulai penggabungan nukleotida yang saling melengkapi dengannya. Ketika nukleotida bergabung bersama (polimerisasi asam nukleat), ia melepaskan kelompok pirofosfat (dua kelompok fosfat terikat satu sama lain) dan energi. Setiap penambahan nukleotida melepaskan jumlah pirofosfat equimolar. Pyrophosphate mengkonversi ke ATP oleh ATP sulfurylase dengan adanya substrat APS. ATP yang dihasilkan menggerakkan konversi luciferin yang diminyalkan luciferin menjadi oxyluciferin, menghasilkan cahaya tampak dalam jumlah yang sebanding dengan jumlah ATP. Cahaya dideteksi oleh alat deteksi foton atau oleh photomultiplier dan menciptakan pyrogram. Apyrase mendegradasi ATP dan dNTPs yang tidak tergabung dalam campuran reaksi. Penambahan dNTP dilakukan satu per satu. Karena penambahan nukleotida diketahui sesuai dengan penggabungan dan deteksi cahaya, urutan tempelan dapat ditentukan.Pyrogram digunakan untuk menghasilkan urutan nukleotida DNA sampel seperti yang ditunjukkan pada Gambar 03.

Pyrosequencing sangat penting dalam analisis polimorfisme nukleotida tunggal dan sekuensing peregangan DNA pendek. Akurasi, fleksibilitas, kemudahan otomatisasi dan pemrosesan paralel yang tinggi adalah keunggulan pyrosequencing atas teknik sekuensing Sanger.

Gambar 03: Pyrosequencing

Apa perbedaan antara Sanger Sequencing dan Pyrosequencing?

Bagian Tengah Sebelum Tabel ->

Sanger Sequencing vs Pyrosequencing

Susunan sekuensing adalah metode sekuensing DNA yang didasarkan pada penggabungan ddNTPs secara selektif dengan DNA polimerase dan penghentian rantai.

Pyrosequencing adalah metode sekuensing DNA yang didasarkan pada pendeteksian pelepasan pirofosfat pada penggabungan nukleotida.
Penggunaan ddNTP	ddNTPs digunakan untuk menghentikan replikasi DNA
ddNTPs tidak digunakan.
Enzim yang terlibat	DNA polimerase digunakan.
Empat enzim digunakan: DNA polimerase, ATP sulfurylase, Luciferase dan Apyrase.
Substrat yang Digunakan	APS dan Luciferin tidak digunakan.
Adenosin 5 'phosphosulfate (APS) dan luciferin digunakan.
Suhu Maksimum	Ini adalah proses yang lambat.
Ini adalah proses yang cepat.
Ringkasan - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing	Susunan sekuensing dan Pyrosequencing adalah dua metode sekuensing DNA yang digunakan dalam biologi molekular. Urutan sekuens menyusun urutan nukleotida secara berurutan dengan menghentikan pemanjangan rantai sementara pyrosequencing menyusun urutan nukleotida yang tepat secara berurutan dengan menggabungkan nukleotida dan mendeteksi pelepasan pirofosfat. Oleh karena itu, perbedaan utama antara sekuens Sanger dan Pyrosequencing adalah bahwa sequencing Sanger bekerja pada sekuensing dengan penghentian rantai sementara pyrosequencing bekerja pada sekuensing dengan sintesis.

Referensi:

1. Fakruddin, Md, dan Abhijit Chowdhury. "Pyrosequencing-Alternatif untuk Sanger Sanger Tradisional. "American Journal of Biochemistry and Biotechnology. Publikasi Ilmu Pengetahuan, 02 Mar. 2012. Web. 28 Feb. 2017.

2. "Santai sekuensing. "Sanger sequencing - Topik ScienceDirect. N. hal., n. d. Web. 28 Feb. 2017

Gambar Courtesy:

1. "Didesoxy-Methode" Oleh Christoph Goemans (modifiziert) - Dr. Norman Mauder, auf Dasar einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3. 0) via Commons Wikimedia

2. "Sanger-DNA-seq" Oleh Enzo di Wikipedia bahasa Polandia (CC BY-SA 3. 0) via Commons Wikimedia

3. "Pyrosequencing" oleh mikrobiologi byte (CC BY-SA 2. 0) melalui Flickr